Resident Evil: Zerossa ohjataan kahta hahmoa, Rebecca Chambersia ja Billy Coenia. Hahmot voivat toimia yhdessä, jolloin pelaaja ohjaa toista hahmoa ja tekoäly toista, mutta ne voivat toimia myös erikseen. Ohjattavaa hahmoa voi vaihtaa napin painalluksella.
Peli sijoittuu juonellisesti ensimmäiseksi osaksi pelisarjassa. Raccoon Cityn S.T.A.R.S.-ryhmän Bravo-tiimi on etsimässä syytä raaoille murhille Arklayvuorilla. Vuoristossa Bravon helikopteriin tulee moottorivika, mikä aiheuttaa pakkolaskun metsään. Bravon jäsenet löytävät sotilaspoliisien kuljetusauton, jonka kuljettajat ovat tapettu. Tiimi päättää hajaantua, jolloin peli lähtee seuraamaan nuorta ja vielä melko kokematonta, ensiapuun erikoistunutta poliisia, Rebecca Chambersia.
